一、差速离心法(又称分步离心法) 用不同的离心速度和离心次数逐步离心不同沉降速度的颗粒的方法称为差速离心。操作时,将含有两种不同颗粒的悬浮液以正常速度离心,使大颗粒下沉,将上清液倒入另一个离心管中,然后增加离心力,离心一定时间,分离小颗粒。差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。差速离心法的优点是:操作简单,离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开,并可使用容量较大的角式转子;分离时间短、重复性高;样品处理量大。缺点是:分辨率有限、分离效果差,沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开,不能一次得到纯颗粒;壁效应严重,特别是当颗粒很大或浓度很高时,在离心管一侧会出现沉淀;颗粒被挤压,离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。
二、速率区带离心法:根据被分离的颗粒在离心力作用下在梯度液体中的沉降速度不同,经过离心后,不同沉降速度的颗粒处于不同的密度梯度层中,形成几个分离的样品区,从而达到相互分离的目的。常用的分离溶液有菲科尔、佩尔科尔和蔗糖。分离静脉血中的单核细胞。前一种分离溶液将单核细胞(淋巴细胞和单核细胞)分成一层。而Percoll分离液将血液中的淋巴细胞和单核细胞分成两个梯度层,分别提取。后者的分离效果优于前者,但操作繁琐。
三、等密度区带离心法:当不同颗粒存在浮力密度差时,在离心力场下,颗粒或向下沉降,或向上浮起,一直沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上(即等密度点)形成区带,称为等密度区带离心法。等密度区带离心的有效分离取决于颗粒的浮力密度差,密度差越大,分离效果越好,与颗粒的大小和形状无关,但后两者决定着达到平衡的速率、时间和区带的宽度。
四、分析性超速离心法①分析型超速离心机的工作原理:分析型超速离心机主要由一个椭圆形的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。该转子通过一个柔性的轴连接成一个高速的驱动装置,此轴可使转子在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转,其容纳两个小室:分析室和配衡室。分析室的容量一般为1ml,呈扇形排列在转子中,其工作原理与一个普通水平转子相同。分析室有上下两个平面的石英窗,实验室离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质,可以通过对紫外光的吸收(如对蛋白质和DNA)或折射率的不同对沉降物进行监测。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就像一个折射的透镜,结果在检测系统的照相底板上产出一个“峰”,由于沉降不断进行,界面向前推进,故“峰”也在移动,从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标。
五、密度梯度离心法(又称区带离心法) 该法又分为速率区带离心法和等密度区带离心法。样品在一定的惰性梯度介质中离心沉淀或沉降平衡,颗粒在一定的离心力作用下分布到梯度液体中的特定位置,形成不同区域的分离方法。这种方法的优点是:分辨率好,分离效果好,一次可以得到纯净的颗粒;适用范围广,既能分离沉淀系数差的颗粒,又能分离具有一定浮力密度的颗粒;颗粒不会积压和变形,可以保持颗粒的活性,并且可以防止由于对流形成的区域的混合。缺点是:离心时间长;需要制备梯度液体;操作严格,不宜掌握。
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